서 론

전 세계적으로 양식 산업이 급성장함에 따라 양식 생물의 질병 발생도 증가하게 되었고 양식 현장에서 수산용 의약품의 사용 빈도 또한 증가하고 있다. 수산용 의약품의 오 · 남용으로 인해 내성균이 출현하게 되고(Smith et al., 1994) 양식 생물의 안전성과 수산식품의 공중위생학적 안전성에 심각한 문제를 일으키기도 한다(Katz and Brady, 2000). 기존의 수산용 의약품에 내성을 가지는 균주를 억제하기 위해서는 새로운 의약품을 사용하여야 한다. 현재 포유류나 가금류에 사용하고 있는 동물용 의약품들 중에서 어류에 질병을 일으키는 세균에도 좋은 치료 효과를 나타내는 항생제들은 수의사로부터 처방 받고 구매하여 어류에도 사용할 수 있다. 하지만 이 동물용 의약품들은 어종별, 항생제별로 적절한 용량과 용법이 정해져 있지 않고, 수산질병관리사를 통한 처방과 구매가 불법인 상황이다. 그럼에도 불구하고, 일부 양식 어가에서 불법적으로 동물용 의약품을 사용하는 사례가 발생하고 있다.

Pleuromutilin은 담자균류인 Pleurotus mutilus에서 처음 발견되었고(Kavanagh et al., 1951), pleuromutilin으로부터 반합성된 tiamulin은 세균 ribosome의 50S subunit을 타겟으로 하여 peptidyl transferase center에서 세포벽 합성을 억제하여 정균활성을 나타낸다고 알려져 있다(Bøsling et al., 2003). Tiamulin은 Mycoplasma gallisepticum, M. synoviae, M. meleagridis 그리고 M. iowae와 같은 Mycoplasma 균주들에 강한 항균활성을 나타내며 그람 양성균에도 좋은 항균성을 나타내지만 그람 음성균에는 비교적 약한 활성을 나타낸다(Werner et al., 1978; Messier et al., 1990). Tiamulin은 돼지와 가금류의 이질, 폐렴, mycoplasma 감염에 대한 치료제로써 축산 농가에서 주로 사용되고 있으며, 돼지의 장관 전염병으로써 대장의 염증과 혈액성 하리가 특징인 돈적리에 효과적이다.

Streptococcus parauberis는 우리나라 강도다리 양식 현장에서 여름철 고수온기에 많은 피해를 입히는 원인 균주로써(Woo and Park, 2013) S. parauberis에 감염된 어류는 외부 증상으로 출혈과 농양을 동반한 안구 돌출, 체색 흑화 등이 나타나고 내부 증상으로는 비장과 간의 비대, 복부와 복벽의 점상출혈 등이 나타난다고 알려져 있다(Doménech et al., 1996).

이번 연구에서는 우리나라의 강도다리 양식 현장에서 발생하는 주요한 질병인 연쇄구균병에 대한 치료제로써 tiamulin의 유효성과 안전성에 관한 연구를 수행하였다. 연쇄구균에 감염된 강도다리에 다양한 농도별, 방법별로 항생제를 투여하여 나타나는 치료 효과를 확인하였으며, 고농도로 tiamulin을 투여하여 강도다리의 내부 조직에 항생제가 어떤 영향을 미치는지 확인하여 수산용 항생제로써의 적용가능성을 검토해 보았다.

재료 및 방법

1. 실험어

강도다리는 경상북도 포항 소재의 한 양식장으로부터 구입하였으며 S. parauberis에 감염된 이력이 없는 것을 사용하였다. 농도별 근육주사 실험에 사용된 강도다리는 평균 체장 12.3 ± 0.8 cm, 평균 체중 38.2 ± 2.3 g이었으며 농도별 경구투여 실험과 근육주사와 경구투여 후 안전성 검사에 사용된 강도다리는 평균 체장 10.5 ± 0.7 cm, 평균 체중 29.6 ± 1.3 g이었다. 실험에 사용하기 전 일주일간 250 ℓ의 유수식 수조에 순치하였다. 수조의 유수량은 수조 당 1.44 l/min이었고 지속적인 유수를 통하여 수질을 유지하였다.

2. 항생제

근육주사용 tiamulin은 엘캄코바이오사의 바이오-티아물린 10%주(본제 1 ml 중 tiamulin hydrogen fumarate 100 mg 함유)를 사용하였으며 경구투여용 tiamulin은 (주)우진B&G의 데나가드39(본제 1 kg 중 tiamulin hydrogen fumarate 39 g 함유)를 사용하였다.

3. 균주

2015년에 경상북도 영덕의 한 양식장에서 연쇄구균에 감염된 강도다리로부터 분리된 S. parauberis HFTC0083 균주를 사용하여 인위감염 실험을 진행하였다. 사용 균주는 1% NaCl이 첨가된 Brain Heart Infusion Agar (BHIA; Difco., USA) 증균 배지를 사용하여 27℃에서 24시간 배양하였고 배양된 균주는 인위감염에 사용하였다. 균주는 실험에 사용될 때까지 -80℃에 보관하였다. 인위감염 후 폐사하는 개체의 신장과 비장으로부터 균을 재 분리하여 동정하기 위해 특이적인 primer (Mata et al., 2004)를 이용한 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 동정하였으며 PCR 조건은 94℃에서 2분간 initial denaturation 하고, 후에 92℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에 1분 30초를 1회로 하여 총 25회 반응시켰으며, 마지막으로 72℃에서 5분간 final extension 하였다(Table 1).

4. 근육주사의 농도별 유효성 조사

강도다리에 대한 tiamulin의 근육주사 농도별 유효성을 확인하기 위하여 Joo et al. (2019)의 연구에서 기술한 방법을 참고하여 실험을 진행하였다. 실험 수온은 24~25℃를 유지하였으며, PBS에 현탁시킨 S. parauberis HFTC0083 균주를 어체 당 3×103 CFU의 농도로 $100~\mu l$를 피하주사 하여 인위감염을 실시하였다. 인위감염을 실시한 지 24시간 후에 주사용 tiamulin을 어체중(kg) 당 각각 $5$, $10$, $15~mg$이 되도록 PBS에 희석하여 $100~\mu l$를 등근육에 주사하였다. 음성 대조구는 세균 접종 대신 PBS를 동량 피하주사하고 24시간 후에 항생제 대신 PBS를 동량 근육주사 하였다. 양성 대조구는 인위감염을 실시하였고 24시간 후에 항생제 대신 PBS를 동량 근육주사 하였다. 대조구는 각각 12마리, 실험구는 각각 24마리의 강도다리를 사용하였다. 인위감염 후 2주간 폐사율을 관찰하였으며 15일째에 각 실험 수조의 생존한 개체들을 마취시킨 후 해부하고 신장을 0.1 g (ml) 적출한 뒤 PBS와 함께 마쇄하여 단계 희석하고 BHIA 배지에 도말하여 감염률을 확인하였다.

5. 경구투여의 농도별 유효성 조사

강도다리에 대한 tiamulin의 경구투여 농도별 유효성을 확인하기 위하여 Joo et al. (2019)의 연구에서 기술한 방법을 참고하여 실험을 진행하였다. 실험 수온과 인위감염 조건은 근육주사 농도별 유효성 확인 실험과 같은 조건으로 진행되었다. 앞선 실험에서 결정된 최적 농도와 2배 농도로 설정하여 실험을 진행하였다. 인위감염을 실시한 지 24시간 후에 경구투여용 tiamulin을 어체중(kg) 당 각각 $15$, $30~mg$이 되도록 PBS에 희석하였고 $100~\mu l$를 zonde를 사용하여 5일간 1일 1회 경구투여 하였다. 각 실험구 당 20마리의 강도다리를 사용하였다. 인위감염 후 2주간 폐사율을 관찰하였으며 15일째에 생존한 개체들의 감염률을 확인하였다.

6. 근육주사와 경구투여 후 강도다리의 안전성 분석

Tiamulin이 어체에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Joo et al. (2019)의 연구에서 기술한 방법을 참고하여 병리조직학적 분석을 진행하였다. PBS를 $100~\mu l$ 근육주사 또는 경구투여한 대조구, 근육주사용 tiamulin을 PBS에 희석하여 $15$, $30$, $60~mg~kg^{-1}$의 농도로 $100~\mu l$ 근육주사한 세 가지 실험구와 경구투여용 tiamulin을 PBS에 희석하여 $15$, $60~mg~kg^{-1}$의 농도로 $100~\mu l$ 경구투여한 두 가지 실험구로 나누었고 각 실험구 당 20마리의 실험어를 사용하였다. 근육주사는 1회 실시하였으며 24시간 동안 나타나는 폐사율을 확인하였다. 경구투여는 5일간 1일 1회 투여하였으며 경구투여한지 0(대조구), 1, 2, 4, 7, 14, 21일 후에 각 수조에서 3마리씩 무작위로 선택하여 마취하고 해부하여 간, 신장, 근육 조직을 적출하였다. 적출한 조직을 10% 중성 포르말린 용액에 전 고정하였고 세절한 후 동일한 고정액에 후 고정하였으며 70%에서 100% 에탄올로 순차적인 탈수, xylene으로 투명화, paraplast로 치환 과정을 통하여 각 장기를 $4~\mu m$ 두께로 절편 제작하여 H&E 염색을 실시하였다. 그 후에 염색된 장기 절편들은 광학 현미경상에서 400배율로 관찰하였다. 관찰하여 나타나는 병적 증상은 정도에 따라 정상, 경도, 중등도, 심도로 구분하였다.

결 과

1. 근육주사의 농도별 유효성

최초 폐사는 $15~mg~kg^{-1}$ 실험구에서 발생하였고 day post challenge (DPC) 1에서 8.3%의 폐사율을 보였다. 양성 대조구와 $5~mg~kg^{-1}$ 실험구의 최종누적폐사율은 92%로 나타났고 $10~mg~kg^{-1}$ 실험구의 폐사율은 100%, $15~mg~kg^{-1}$ 실험구의 폐사율은 96%로 확인되었다. 음성 대조구에서는 15일간 폐사가 나타나지 않았다(Fig. 1). 실험 종료 후 생존한 개체들의 감염률 확인 결과, 감염된 개체는 없었다(Table 2).

2. 경구투여의 농도별 유효성

최초 폐사는 양성 대조구와 $30~mg~kg^{-1}$ 실험구에서 발생하였다. 양성 대조구와 $15~mg~kg^{-1}$ 실험구의 최종누적폐사율은 95%로 나타났고 $30~mg~kg^{-1}$ 실험구의 경우 100%의 폐사율이 확인되었다. 음성 대조구에서는 15일간 폐사가 나타나지 않았다(Fig. 2). 실험 종료 후 생존한 개체들의 감염률 확인 결과, 양성 대조구에서는 100%로 나타났고 음성 대조구와 $15~mg~kg^{-1}$ 실험구는 0%로 확인되었다(Table 3).

3. 근육주사와 경구투여 후 강도다리의 안전성

근육주사 24시간 후 $30~mg~kg^{-1}$ 실험구의 폐사율은 25%로 나타났고 $60~mg~kg^{-1}$ 실험구의 폐사율은 60%로 나타났다(data not shown). 경구투여한 실험구에서는 $60~mg~kg^{-1}$ 실험구에서 3일차에 1마리, 4일차에 2마리의 폐사가 발생하였다. 조직검사 결과 모든 실험구에서 지방간이 관찰되었고(Fig. 3-9) 신장에서는 모든 실험구에서 전반적으로 경도의 조혈활성이 나타났고(Fig. 3-9) $15~mg~kg^{-1}$ 실험구에서는 1일차(Fig. 4-q), 2일차(Fig. 5-k)에서 중등도의 조혈활성이 관찰되었다. $60~mg~kg^{-1}$ 실험구에서는 1일차(Fig. 4-t, w)와 4일차(Fig. 6-w, z), 7일차(Fig. 7-t, w, z), 14일차(Fig. 8-t), 21일차(Fig. 9-z)에서 중등도의 조혈활성이 나타났다. 또한 신장에서 전반적으로 경도의 세뇨관 위축이 나타났으며 $15~mg~kg^{-1}$ 실험구에서는 1일차(Fig. 4-n, q)와 14일차(Fig. 8-k), 21일차(Fig. 9-t)에서 중등도의 세뇨관 위축이 나타났고 $60~mg~kg^{-1}$ 실험구에서는 1일차(Fig. 4-w)와 2일차(Fig. 5-t), 7일차(Fig. 6-t, z)에서 중등도의 세뇨관 위축이 확인되었다. 그리고 신장에서 전반적으로 중등도의 reticuloendothelial system (RES) 활성이 확인되었다. 근육에서는 모든 실험구에서 특별한 증상이 발견되지 않았으며 유의적인 차이가 관찰되지 않았다.

고 찰

이번 연구에서는 S. parauberis에 의한 연쇄구균병에 걸린 강도다리에 대한 tiamulin 주사제의 유효 농도를 확인해 보기 위해 $5~mg~kg^{-1}$, $10~mg~kg^{-1}$, $15~mg~kg^{-1}$의 농도로 설정하여 시험하였다. 농도 설정은 돈적리가 발병한 돼지에 대한 tiamulin 주사치료에 관한 연구(Burch et al., 1983)에서 설정한 실험 농도 $10~mg~kg^{-1}$, $15~mg~kg^{-1}$과 제조사의 제품 사용기준인 $10~mg~kg^{-1}$을 참고하였다. In vitro에서 S. parauberis HFTC0083에 대한 tiamulin hydrogen fumarate의 최소억제농도(Minimal inhibitory concentration, MIC) 확인 결과 $1~\mu g~ml^{-1}$로 강한 감수성을 나타냈지만(data not shown) in vivo에서 근육주사와 경구투여 실험 결과에서는 치료 효과가 나타나지 않았다. 시험관 내에서 측정한 MIC로는 생체 내의 반응을 정확하게 예측할 수 없으며 투여한 항생제의 대부분이 체내에서 혈청 단백질과 결합된 상태로 존재하여 일부분만이 조직 내로 확산되는 경우에는 치료 효과를 기대하기 어려운 경우가 있다(Lee and Shin, 2008).

Tiamulin의 강도다리에 대한 안전성을 확인하기 위해 주사제로 강도다리의 등근육에 $15$, $30$, $60~mg~kg^{-1}$의 농도로 주사하였고 $30$, $60~mg~kg^{-1}$ 실험구에서는 주사 후 10분 이내에 주사 부위의 피부가 검게 변색되는 것을 관찰할 수 있었으며(Supplementary Fig. 1) 주사 후 3시간 이내에 각각 25%, 60%의 폐사가 나타난 것을 확인할 수 있었다. 또한 경구투여용 항생제를 5일간 $15$, $60~mg~kg^{-1}$의 농도로 투여하였을 때 $60~mg~kg^{-1}$의 실험구에서 총 3마리의 폐사가 발생하였고, 병원체 감염 여부를 확인해 본 결과 감염되지 않은 것으로 확인되었기 때문에 고농도의 항생제 투여로 인한 폐사로 생각된다. 그리고 병리조직학적 검사 결과 전체 실험구에서 지방간이 관찰되었고, 신장의 경우 모든 실험구에서 전반적으로 약한 조혈활성과 세뇨관 위축이 나타났으며 중등도의 RES 활성이 확인되었다. 돼지의 경우 tiamulin 주사제(Denagard 10% injection, Premier Shukuroglou, Athens, Greece)를 과다투여하면 타액 분비, 구토 방향감각 상실, 간장 경련 등을 일으킬 수 있다고 명시되어 있다. 이외에도 European Medicines Agency (1999)의 연구에 따르면, 간 중량 증가나 지방 축적이 발생하거나, 신근장애, 저칼슘혈증, 심실 빈맥성 부정맥 등의 증상에 대한 지표인 QT interval의 연장(Nachimuthu et al., 2012)과 심한 저칼륨 혈증, 동성맥, heart block을 야기할 수 있는 double peaked T-waves의 증가(Lionte et al., 2012) 등의 증상이 발생할 수 있다. 조혈활성은 평소에는 휴지기였다가 혈중 내에 세균이나 약물이 침투하게 되었을 때 활성이 나타난다. 특히 항생제의 부작용으로 인해 빈혈, 혈소판 감소, 백혈구 감소 등이 발생할 수 있으며 항생제 투여를 중단하게 되면 회복을 하기 위해 조혈활성이 나타날 수 있다(Josefsdottir et al., 2017). 세포질이 넓어지고 대식세포의 활성화가 이루어지는 현상을 RES 활성이라고 하며 조직에서 거즈모양으로 나타난다. RES 활성이 나타나는 조직에는 대식세포 등과 같은 포식세포들이 항진하고 있고 조직에서 흰색으로 나타난다. 또한 혈중 내에 세균 감염이나 항생제 같은 약물에 의해 활성화 될 수 있다고 알려져 있다. 세뇨관이 공포화 된 것은 세뇨관에 직접적인 독성이 영향을 미쳤기 때문이며 이 또한 항생제에 의해 손상을 입은 것으로 생각된다.

결론적으로, tiamulin은 연쇄구균에 감염된 강도다리에 대한 치료 효과가 미비하며 일정 수준 이상의 농도에서 숙주에 대한 강한 독성반응을 일으켜 숙주를 폐사로 이르게 하는 부작용이 심각하였다. 따라서 연쇄구균에 감염된 강도다리에는 적합한 항생제라고 볼 수 없다고 생각된다.